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Commessa ME-P05-006

 

Cromosomi artificiali per terapia genica. Studi sulla replicazione del DNA in cellule umane; controllo del ciclo cellulare e della proliferazione.

 

Responsabile: Alessandra Montecucco

Personale afferente: Fiorenzo Peverali, Simone Sabbioneda

 

La replicazione del DNA occupa una posizione centrale nel ciclo cellulare ed è soggetta a numerosi meccanismi di controllo tesi a coordinarla con gli altri momenti della vita della cellula. L’obiettivo di questa unità di ricerca è di caratterizzare i meccanismi che controllano la replicazione del DNA sia nella fase di inizio che in quella di allungamento, sia durante la progressione del ciclo cellulare che in condizioni di stress replicativo. Un altro obiettivo è di utilizzare origini di replicazione del DNA umano come elementi costitutivi di vettori di espressione per applicazioni biotecnologiche. 

- L’origine di replicazione associate al gene dalla Lamina B2 (LamB2-Ori) è in grado di prevenire il silenziamento genico. In collaborazione con la ditta Avantea sono stati messi a punto e validati vettori basati sul Lamb2-Ori e sulla tecnologia RMCE che hanno permesso l’espressione stabile del gene reporter EGFP in maniera stabile e durevole anche in assenza di pressione selettiva.

- Difetti in enzimi della replicazione possono indurre rotture della doppia elica durante l’evento replicativo. L’ipotesi di lavoro è che un aumentato livello basale di danni sul DNA possa influenzare l’espressione genica e l’identità cellulare. Per verificare questa ipotesi sono state utilizzate cellule umane mutate nel gene della DNA ligasi I che mostrano un aumentato livello basale di rotture del DNA prodotte durante la fase S in seguito ad una non corretta maturazione dei frammenti di Okazaki. Sono in corso esperimenti di biologia cellulare e molecolare, oltre che di RNA-Seq e ChIP-Seq, per comprendere l’impatto del danno sul DNA sui profili di espressione. Aumentati livelli di danno sul DNA si osservano normalmente nelle cellule tumorali, sia a causa di condizioni stressanti nel microambiente tumorale che per il sostenuto tasso di replicazione. Condizioni simili si verificano anche durante le prime fasi dell’embriogenesi. Questi studi possono aprire nuove prospettive per l'analisi i) dei programmi di differenziamento cellulare durante l’embriogenesi e 2) della progressione tumorale. 

- Nell’ambito del progetto MbMM (CNR-Regione Lombardia), in collaborazione con l'Istituto di Neuroscienze del CNR (Milano), è stato recentemente intrapreso lo studio della risposta cellulare allo stress replicativo e al danno sul DNA in modelli cellulari di malattie neurodegenerative. 

- La polimerasi eta è importante per i processi di tolleranza al danno dopo irraggiamento. Gli studi si concentrano sull’identificazione dei siti di fosforilazione della polimerasi eta e di nuove proteine interattrici. I dati ottenuti suggeriscono che queste modificazioni siano parte di un complesso network regolativo. Il principale interattore analizzato è la ubiquitin ligasi UBR5, identificata tramite spettrometria di massa. L’assenza di questa proteina altera la velocità delle forche replicative. Sono in corso studi di biologia molecolare e cellulare per comprendere i meccanismi alla base di questo effetto. 


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