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IL NUCLEO CELLULARE E LA REPLICAZIONE DEL DNA


Inizio della replicazione: Dissezione di una origine di replicazione del DNA umano

Fiorenzo Peverali


La corretta duplicazione del materiale genico è essenziale per la sopravvivenza  delle cellule e dell’organismo. Non è sorprendente perciò che il processo replicativo sia soggetto a numerosi meccanismi di controllo tesi a verificarne la fedeltà ed ad assicurare che ogni sequenza di DNA sia duplicata una ed una sola volta durante il ciclo cellulare. Un punto cruciale è la selezione delle sequenze da dove iniziare la sintesi del DNA. Studi in organismi modello, come i batteri, virus ed eucarioti unicellulari (lievito) hanno dimostrato la validità del modello del “replicone” secondo il quale la sintesi del DNA parte in corrispondenza di specifiche sequenze di DNA chiamate “origini”. Queste sono riconosciute da proteine “iniziatore” che reclutano il macchinario di replicazione (replisoma) sulla molecola di DNA. Alcuni dati sembrano indicare che questo modello non sia valido nei mammiferi e suggeriscono che il contesto cromatinico o elementi diversi dalla sequenza del DNA possano direttamente influenzare la scelta dei siti di inizio della replicazione. Il modello alternativo a quello del replicone prevede che nelle cellule di mammifero la sintesi di DNA parta in modo casuale all’interno di regioni estese e poco definite e chiamate “zone di inizio”. Questo meccanismo probabilmente riflette la mancanza di specificità di legame del complesso iniziatore delle cellule di mammifero noto come ORC (Origin Recognition Complex) che non mostra alcuna preferenza di legame per specifiche sequenze di DNA.

Il nostro laboratorio, in collaborazione con il gruppo del Prof. Arturo Falaschi, ha contribuito in modo significativo all’analisi delle origini di replicazione del DNA in cellule umane cercando di comprendere quale tra i due modelli alternativi (origine specifica e origine delocalizzata) sia effettivamente utilizzato. Abbiamo isolato una delle poche origini di replicazione del DNA umano identificate. Questa origine, nota come “LamB2-ori”, è localizzata in un regione di 400 bp che contiene l’estremità 3’ del gene della lamina B2 e l’isola CpG associata al promotore del gene TIMM13. In corrispondenza dell’origine si forma un complesso multiproteico detto OBP (Origin Binding Protein). La formazione del complesso OBP è controllata durante il ciclo cellulare. Oltre alle proteine del complesso pre-replicativo (ORC, Cdc6 e MCM) OBP contiene proteine che controllano lo stato topologico del DNA (Topoisomerasi I e II). La regione legata da OBP comprende il sito di inizio della replicazione bidirezionale (OBR, Origin of Bidirectional Replication). Noi abbiamo identificato con la precisione del nucleotide i siti di inizio delle due eliche progressive (leading). I nostri dati sono in accordo con il modello secondo il quale la replicazione inizia da una sequenza precisa di DNA piuttosto che casualmente all’interno di una “zona d’inizio”.

Più di recente abbiamo focalizzato i nostri sforzi sulla dissezione dell’origine tentando di identificare gli elementi di sequenza indispensabili per questa funzione. Abbiamo dimostrato che un frammento di 1.2 kb che comprende il sito di inizio della replicazione, il sito di legame di OBP e l’isola CpG associata al promotore del gene TIMM13 si comporta come un’origine di replicazione quando integrata in posizioni differenti del genoma umano (LamB2 ori ectopica). Grazie ad una serie di mutanti, siamo riusciti a dimostrare che l’attività dell’origine è controllata sia da elementi prossimali ad OBR sia dall’isola CpG. E’ perciò evidente che specifici elementi di sequenza hanno un ruolo fondamentale nel definire l’attività dell’origine.




Figura 4. In alto: Rappresentazione schematica della regione genomica che contiene l’origine di replicazione associata al gene della Lamina B2 (LamB2 ori). Sotto è mostrato il frammento da 1.2 kb che comprende l’origine e l’isola CpG associata al promotore del gene TIMM13.
In basso: Il pannello di sinistra mostra l’analisi per PCR dell’attività di LamB2 ori ectopica. Il pannello di destra mostra la quantificazione dell’attività dell’origine ectopica in posizioni differenti all’interno del genoma umano. La barra rossa indica l’attività dell’origine endogena presa come riferimento.


Al fine di descrivere più in dettaglio quali elementi di sequenza siano essenziali per l’attività dell’origine abbiamo recentemente sviluppato un saggio che permette di confrontare l’attività delle varie origini mutate all’interno di una stessa regione genomica.

Le origini di replicazione sono elementi essenziali per la costruzione di cromosomi artificiali. Proprio per questo la nostra attività di ricerca può avere ricadute importanti in campo biotecnologico.


Referenze

  1. Falaschi A, Abdurashidova G, Sandoval O, Radulescu S, Biamonti G, Riva S. (2007) Molecular and structural transactions at human DNA replication origins. Cell Cycle. 6(14):1705-12.
  2. Abdurashidova G, Radulescu S, Sandoval O, Zahariev S, Danilov M, Demidovich A, Santamaria L, BiamontiI G, Riva S, and Falaschi A. (2007) Functional interactions of DNA topoisomerases with a human replication origin.- The EMBO Journal . 26(4): 998-1009
  3. Paixao S, Colaluca IN, Cubells M, Peverali FA, Destro A, Giadrossi S, Giacca M, Falaschi A, Riva S, Biamonti G. (2004) Modular structure of the human lamin B2 replicator. Mol Cell Biol. 24:2958-67.
  4. Biamonti G, Paixao S, Montecucco A, Peverali FA, Riva S, Falaschi A. (2003) Is DNA sequence sufficient to specify DNA replication origins in metazoan cells? Chromosome Res. 11:403-12.
  5. Gabellini D, Colaluca IN, Vodermaier HC, Biamonti G, Giacca M, Falaschi A, Riva S, Peverali FA. (2003) Early mitotic degradation of the homeoprotein HOXC10 is potentially linked to cell cycle progression. EMBO J. 22:3715-24.
  6. de Stanchina E, Gabellini D, Norio P, Giacca M, Peverali FA, Riva S, Falaschi A, Biamonti G. (2000) Selection of homeotic proteins for binding to a human DNA replication origin. J Mol Biol. 299:667-80.
  7. Abdurashidova G, Deganuto M, Klima R, Riva S, Biamonti G, Giacca M, Falaschi A. (2000) Start sites of bidirectional DNA synthesis at the human lamin B2 origin. Science. 287:2023-6.
  8. Abdurashidova G, Riva S, Biamonti G, Giacca M, Falaschi A. (1998) Cell cycle modulation of protein-DNA interactions at a human replication origin. EMBO J. 17:2961-9.

 

 


Dinamica delle replication factories.

Alessandra Montecucco

 

Nelle cellule eucariotiche la replicazione del DNA avviene all’interno di distretti nucleari detti “replication factories” - RF. Oltre ad enzimi direttamente coinvolti nella replicazione del DNA le RF contengono fattori che controllano la fedeltà del processo replicativi e l’assemblaggio della cromatina. Il numero, dimensione e distribuzione delle RF cambia durante la fase S seguendo un preciso programma spazio-temporale. Sono stati descritti 5 quadri di distribuzione ognuno dei quali si verifica in uno specifico momento della fase S. I singoli quadri sono associati alla replicazione di specifiche porzioni del genoma. Ad esempio, l’eucromatina viene replicata all’inizio della fase S in un gran numero di RF molto piccole e distribuite nell’intero nucleo. La replicazione dell’eterocromatina pericentromerica avviene in RF molto grandi adiacenti ai nucleoli o alla membrana nucleare. Infine, le masse eterocromatiche dei centromeri sono replicate in grosse RF alla fine della fase S.

Abbiamo contribuito in modo significativo all’analisi di alcuni aspetti delle RF. Inizialmente abbiamo identificato un motivo proteico nella regione N-terminale del dominio della Ligasi I che è necessario per il reclutamento dell’enzima ai siti di attiva replicazione del DNA. Questo motivo è presente in numerose altre proteine che si trovano nelle RF e corrisponde al sito di legame con il fattore replicativo PCNA. Sulla base di questo risultato abbiamo ipotizzato che uno dei ruoli principali di PCNA sia quello di dirigere la formazione delle RF.





Figura 5. Analisi al microscopio confocale della distribuzione della DNA Ligasi I (un marcatore delle replication factories) e dei siti di incorporazione di BrdU (foci di replicazione). L’immagine sovrapposta (Merge) mostra che i due marcatori colocalizzano.

 

Il dominio regolativo N-terminale della Ligasi I contiene oltre al motivo di legame a PCNA anche alcuni amino acidi che sono fosforilati in momenti differenti del ciclo cellulare. La funzione di queste fosforilazioni non è ancora compresa. Tuttavia il fatto che questi amino acidi siano modificati secondo un preciso ordine temporale suggerisce che la fosforilazione possa in qualche modo modulare l’associazione dell’enzima con i complessi replicativi.

Abbiamo proposto che l’attività e distribuzione delle replication factories sia controllata da specifici circuiti di regolazione e che la fosforilazione degli enzimi replicativi sia una parte di questo sistema di regolazione. Per verificare questa ipotesi abbiamo studiato la dinamica delle replication factories in risposta a trattamenti con farmaci antitumorali che inducono l’attivazione dei checkpoint che controllano la risposta al danno sul DNA. Abbiamo trovato che il farmaco antitumorale etoposide, un veleno della DNA topoisomerasi II induce la scomparsa delle replication factories e la redistribuzione delle proteine replicative. Questo evento richiede l’attività del circuito di checkpoint identificato dalla chinasi apicale ATR e da quella a valle Chk1. I nostri dati sono in accordo con un modello secondo il quale l’etoposide induce la formazione di rotture a doppio filamento (DSB) alle spalle della forca replicativa. Tali rotture sono in seguito convertite in regioni a singolo filamento che vengono legate dalla proteina RPA. RPA sarebbe in grado di reclutare ed attiva il circuito ATR/Chk1 che inibisce l’attivazione di altre origini di replicazione. Dato che l’etoposide non induce un blocco immediato della sintesi di DNA, i repliconi già attivati vengono completamente duplicati anche in presenza del farmaco. Abbiamo dimostrato che circuiti differenti sono coinvolti nell’inibizione di origini attivate in momenti diversi della fase S. Infatti, l’inibizione delle RF in fase S precoce dipende dal fattore NBS1 che non è coinvolto nell’inibizione delle RF attivate in momenti successivi della fase S. Tutte le RF sono comunque controllate da Chk1.


Referenze

  1. Montecucco A, Biamonti G. (2006) Cellular response to etoposide treatment. Cancer Lett. 252(1):9-18
  2. Rossi R, Lidonnici MR, Soza S, Biamonti G, Montecucco A. (2006) The dispersal of replication proteins after Etoposide treatment requires the cooperation of Nbs1 with the ataxia telangiectasia Rad3-related/Chk1 pathway. Cancer Res. 66:1675-83.
  3. Lidonnici MR, Rossi R, Paixao S, Mendoza-Maldonado R, Paolinelli R, Arcangeli C, Giacca M, Biamonti G, Montecucco A. (2004) Subnuclear distribution of the largest subunit of the human origin recognition complex during the cell cycle. J Cell Sci. 117:5221-31.
  4. Ferrari G, Rossi R, Arosio D, Vindigni A, Biamonti G, Montecucco A. (2003) Cell cycle-dependent phosphorylation of human DNA ligase I at the cyclin-dependent kinase sites. J Biol Chem. 278:37761-7.
  5. Frouin I, Montecucco A, Biamonti G, Hubscher U, Spadari S, Maga G. (2002) Cell cycle-dependent dynamic association of cyclin/Cdk complexes with human DNA replication proteins. EMBO J. 21:2485-95.
  6. Montecucco A, Rossi R, Ferrari G, Scovassi AI, Prosperi E, Biamonti G. (2001) Etoposide induces the dispersal of DNA ligase I from replication factories. Mol Biol Cell. 12:2109-18.
  7. Rossi R, Villa A, Negri C, Scovassi I, Ciarrocchi G, Biamonti G, Montecucco A. (1999) The replication factory targeting sequence/PCNA-binding site is required in G(1) to control the phosphorylation status of DNA ligase I. EMBO J. 18:5745-54.
  8. Montecucco A, Rossi R, Levin DS, Gary R, Park MS, Motycka TA, Ciarrocchi G, Villa A, Biamonti G, Tomkinson AE. (1998) DNA ligase I is recruited to sites of DNA replication by an interaction with proliferating cell nuclear antigen: identification of a common targeting mechanism for the assembly of replication factories. EMBO J. 17:3786-95.

 

 


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