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BIOLOGIA CELLULARE E MOLECOLARE DEL NUCLEO

Ricercatori afferenti: Fabio Cobianchi, Claudia Ghigna, Alessandra Montecucco, Silvano Riva e Giuseppe Biamonti

Una delle sfide principali della post genomica è quella di comprendere i circuiti molecolari che controllano l’espressione genica nelle cellule umane. Il sequenziamento del DNA ha dimostrato che meno del 5% del genoma umano codifica proteine. Tuttavia, gran parte (forse l’intero) genoma è trascritta in RNA non-codificanti (ncRNA). Nonostante queste molecole siano ancora poco caratterizzate, è oramai accettato che i ncRNA agiscono a diversi livelli nella regolazione dell’espressione genica.    

 


Splicing alternativo e progressione tumorale

Claudia Ghigna, Giuseppe Biamonti


Una frazione significativa di ncRNA è costituita dagli introni che separano gli esoni nei trascritti genici primari. La produzione di una molecola di mRNA codificante traducibile richiede la rimozione degli introni dai trascritti genici primari (pre-mRNA) attraverso una reazione nota come splicing. Il macchinario di splicing, detto spliceosoma, è costituito da 5 particelle ribonucleoproteiche (snRNP U1, U2, U4, U5 e U6) e da più di 100 proteine differenti. Uno dei problemi principali della reazione di splicing è quello di definire le sequenze esoniche. Infatti, i siti di splicing che segnano il confine tra esone ed introne, sono caratterizzati da brevi sequenze consensus e solo il primo e l’ultimo dinucleotide dell’introne sono assolutamente conservati. Questo fa si che il numero di possibili siti di splicing è di gran lunga superiore a quello effettivamente utilizzato. Inoltre in molti casi gli esoni possono essere separati da sequenze introniche di diverse decine di Kb, il che crea un ostacolo evidente al riconoscimento degli esoni da parte dello spliceosoma.  La flessibilità del complesso di splicing nel riconoscere siti di splicing poco conservati favorisce il verificarsi di eventi di splicing non corretti come quelli che si osservano nei tumori. Tuttavia è anche alla base di un fenomeno fisiologicamente importante noto splicing alternativo (AS). Tramite AS un singolo gene può dar origine a mRNA differenti che contengono combinazioni differenti di esoni. AS perciò è un meccanismo potente per espandere la capacità codificante del genoma. E’ stato calcolato che circa il 75% dei geni umani vanno incontro ad eventi di splicing alternativo. Proprio per questo AS riveste un ruolo chiave nella regolazione dell’espressione genica nello sviluppo e nel definire l’identità cellulare.
AS dipende da un numero di RNA binding proteins che non sono componenti stabili dei complessi snRNPs. Queste proteine interagiscono in maniera sequenze specifica con la molecola di pre-mRNA legando sequenze di regolazione dello splicing note come “enhancers” e “silencers” di splicing che si trovano sia negli esoni (ESE: Exonic Splicing Enhancer and ESS: Exonic Splicing Silencer) che negli introni (ISE: Intronic Splicing Enhancer and ISS: Intronic Splicing Silencer).

Uno degli obiettivi del nostro gruppo di ricerca è quello di comprendere come l’alterazione nell’espressione o attività di specifiche RNA binding proteins, che si verifica frequentemente nei tumori, possa influenzare AS e contribuire alla progressione tumorale. Come modello abbiamo utilizzato il proto-oncogene Ron che codifica il recettore di membrana del fattore di “cell scattering” MSP (Macrophage Stimulating Protein). L’interazione con MSP attiva la tirosino chinasi Ron con la conseguente attivazione di cascate di traduzione del segnale che controllano motilità cellulare protezione dell’apoptosi e riorganizzazione del citoscheletro. Questo processo è noto come “invasività cellulare” o “cell scattering” ed è fisiologicamente importante durante lo sviluppo e la rigenerazione tissutale. Inoltre, è cruciale per la Transizione da cellula Epiteliale a cellule Mesenchimale (EMT). EMT si verifica anche durante la progressione tumorale ed è responsabile delle proprietà metastatiche della maggior parte dei carcinomi umani.

 




Figura 1. Rappresentazione schematica della porzione del gene Ron che va incontro a splicing alternativo. Sono indicati gli elementi Enhancer e Silencer nell’esone 12 e l’interazione con il fattore di splicing SF2/ASF.  In basso: Immagini a contrasto di fase di cellule umane 293 trasfettate con un vettore vuoto o con un plasmide che dirige la sovra-espressione del fattore di splicing SF2/ASF.


In seguito alla non utilizzazione (skipping) dell’esone 11 del pre-mRNA del gene Ron si ha la produzione di una isoforma proteica, ΔRon, la cui espressione è sufficiente ad indurre EMT. Il livello dei trascritti ΔRon aumenta nel 75% dei carcinomi della mammella. Noi abbiamo identificato gli elementi di sequenza che controllano lo splicing di Ron. Il fattore di splicing SF2/ASF ha un ruolo cruciale nella scelta tra inclusione e skipping dell’esone 11 ed agisce legandosi ad un elemento ESE localizzato nell’esone 12. Alti livelli di SF2/ASF che si riscontrano spesso nei tumori inducono lo skipping dell’esone 11 con la conseguente produzione di ΔRon. Abbiamo dimostrato che un aumento nei livelli di SF2/ASF è sufficiente ad indurre EMT e a promuovere la motilità cellulare. Al contrario, una riduzione nei livelli di questo fattore di splicing mediati da RNA interference (RNAi) promuove MET (Transizione da cellula mesenchimale a cellula epiteliale). Lo stesso effetto si ottiene quando si riduce, sempre tramite RNAi, l’espressione di ΔRon in cellule che sovraesprimono SF2/ASF. Questo risultato indica che l’effetto sullo splicing alternativo di Ron è cruciale per la capacità di SF2/ASF di indurre EMT.

I nostri studi forniscono la prima chiara evidenza che i livelli di espressione di uno specifico fattore di splicing (SF2/ASF) sono direttamente collegati alla progressione tumorale influenzando il profilo di splicing di uno specifico gene (Ron).


Referenze

  1. Ghigna C, Giordano S, Shen H, Benvenuto F, Castiglioni F, Comoglio PM, Green MR, Riva S, Biamonti G. (2005) Cell motility is controlled by SF2/ASF through alternative splicing of the Ron protooncogene. Mol Cell. 20:881-90.
  2. Shen H, Kan JL, Ghigna C, Biamonti G, Green MR. (2004) A single polypyrimidine tract binding protein (PTB) binding site mediates splicing inhibition at mouse IgM exons M1 and M2. RNA. 10:787-94.
  3. Ghigna C, Moroni M, Porta C, Riva S, Biamonti G. (1998) Altered expression of heterogenous nuclear ribonucleoproteins and SR factors in human colon adenocarcinomas. Cancer Res. 58:5818-24.


RNA non codificanti, eterocromatina e organizzazione strutturale/funzionale del nucleo delle cellule umane

Giuseppe Biamonti


Una delle scoperte più interessanti degli ultimi anni riguarda il ruolo centrale dei ncRNA nella regolazione dell’espressione genica. E’ stato dimostrato, infatti, che i ncRNA controllano aspetti differenti del metabolismo cellulare quali l’organizzazione della cromatina, la trascrizione e la traduzione degli mRNA. I dettagli molecolari di questi circuiti regolativi sono ancora in gran parte poco compresi. E' comunque accettato che piccoli (20-25 nt) RNA, chiamati micro RNA o miRNA, giochino un ruolo chiave in questi processi. Studi negli eucarioti inferiori, come Schizosaccharomyces pombe, hanno dimostrato che miRNAs che originano dalla trascrizione di sequenze ripetute inducono la eterocromatinizzazione di sequenze di DNA omologhe. Numerosi dati indicano che meccanismi simili possano operare anche in cellule di eucarioti superiori, incluso l’uomo. Tuttavia, la situazione è probabilmente più complessa nei metazoi che in lievito dato che molecole più lunghe dei miRNA, come gli RNA coinvolti nel processo di inattivazione del cromosoma X, sono componenti stabili della cromatina. La natura di questi ncRNA è ancora poco nota.

 

Qualche anno fa nostro laboratorio ha descritto una nuova classe di ncRNA lunghi che derivano dalla trascrizione di regioni molto estese del genoma umano costituite da ripetizioni in tandem di DNA Satellite III. Queste regioni sono localizzate nelle regioni eterocromatiche pericentromeriche dei cromosomi umani tra cui il cromosoma 9. Uno dei due filamenti è preferenizialmente trascritto dando origine a trascritti che contengono il filamento ricco in G del SatIII. In condizioni normali il livello di SatIII RNA è molto basso in accordo con l’idea che le regioni eterocromatiche costitutive sono trascrizionalemte silenti. Il loro livello aumenta drasticamente (tra le 10.000 e le 50.000 volte) in seguito a diversi trattamenti stressanti tra cui stress termico (heat shock), presenza di metalli pesanti (Cadmio) e stress iper-osmotico. Un aumento meno significativo (sempre dell’ordine delle 1000 volte) si osserva dopo irraggiamento con luce UV. E’ interessante notare che questi ncRNA rimangono sempre associati o in stretta vicinanza dei siti di trascrizione dove contribuiscono all’assemblaggio di grandi sottocomparti nucleari (fino a 2 µm di diametro) che noi abbiamo chiamato “nuclear stress bodies” o nSBs. Questi SatIII RNAs hanno un ruolo chiave nella formazione dei nSBs dato che sono responsabili del reclutamento in queste strutture di un sottoinsieme specifico di RNA binding proteins normalmente coinvolte nella reazione di splicing.La nostra ipotesi di lavoro è che questi SatIII RNA, oltre ad influenzare l’organizzazione funzionale del nucleo, possano controllare l’espressione di geni specifici agendo a livello post-trascrizionale. La loro capacità di sequestrare in specifici domini nucleari fattori di processamento del pre-mRNA, tra cui il fattore di splicing SF2/ASF, molto probabilmente può influenzare il profilo di splicing alternativo di specifici geni durante la fase di recupero dai trattamenti stressanti.

 




Figure 2. Heat-shocked HeLa cells stained with an oligonucleotide complementary to Satellite III RNAs. Nuclear stress bodies are detectable as bright green spots in the nucleus close to the nucleoli.





Figura 3. Rappresentazione schematica del ciclo di formazione e scomparsa dei nuclear stress bodies dopo trattamento stressanti.


Ci proponiamo: 1) di identificare trascritti il cui splicing alternativo è influenzato dai SatIII RNA; 2) identificare le proteine che si accumulano nei nSBs; 3) verificare il ruolo di questi RNA nel definire la struttura cromatinica del DNA SatIII e 4) identificare condizioni fisiologiche e patologiche che possano portare all’espressione di questi RNA nell’organismo.

 

Referenze

  1. Valgardsdottir R, Chiodi I, Giordano M, Cobianchi F, Riva S, Biamonti G. (2005) Structural and functional characterization of noncoding repetitive RNAs transcribed in stressed human cells. Mol Biol Cell. 16:2597-604.
  2. Chiodi I, Corioni M, Giordano M, Valgardsdottir R, Ghigna C, Cobianchi F, Xu RM, Riva S, Biamonti G. (2004) RNA recognition motif 2 directs the recruitment of SF2/ASF to nuclear stress bodies. Nucleic Acids Res. 32:4127-36.
  3. Biamonti G. (2004) Nuclear stress bodies: a heterochromatin affair?
  4. Nat Rev Mol Cell Biol. 5:493-8.
  5. Rizzi N, Denegri M, Chiodi I, Corioni M, Valgardsdottir R, Cobianchi F, Riva S, Biamonti G. (2004) Transcriptional activation of a constitutive heterochromatic domain of the human genome in response to heat shock. Mol Biol Cell. 15:543-51.
  6. Denegri M, Moralli D, Rocchi M, Biggiogera M, Raimondi E, Cobianchi F, De Carli L, Riva S, Biamonti G. (2002) Human chromosomes 9, 12, and 15 contain the nucleation sites of stress-induced nuclear bodies.  Mol Biol Cell. 13:2069-79.
  7. Denegri M, Chiodi I, Corioni M, Cobianchi F, Riva S, Biamonti G. (2001) Stress-induced nuclear bodies are sites of accumulation of pre-mRNA processing factors. Mol Biol Cell. 12:3502-14.
  8. Chiodi I, Biggiogera M, Denegri M, Corioni M, Weighardt F, Cobianchi F, Riva S, Biamonti G. (2000) Structure and dynamics of hnRNP-labelled nuclear bodies induced by stress treatments. J Cell Sci. 113:4043-53.
  9. Weighardt F, Cobianchi F, Cartegni L, Chiodi I, Villa A, Riva S, Biamonti G.(1999) A novel hnRNP protein (HAP/SAF-B) enters a subset of hnRNP complexes and relocates in nuclear granules in response to heat shock. J Cell Sci. 112:1465-76

 

 


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